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不同于气相色谱

文章出处:易发体育 人气:发表时间:2021-01-27 22:41

  液相色谱仪的结构及组成(施超欧2005)_化学_自然科学_专业资料。液相色谱仪的结构及组成 华东理工大学分析测试中心 施超欧 2005.05.12 二 液相色谱仪的基本结构特点及其组成 1 液相色谱仪的主要厂家(国外) Waters (

  液相色谱仪的结构及组成 华东理工大学分析测试中心 施超欧 2005.05.12 二 液相色谱仪的基本结构特点及其组成 1 液相色谱仪的主要厂家(国外) Waters (北极星 Dionex Summit 液相色谱仪的主要厂家(国内) 大连依利特(北分 上分 历元 大连江申 浙江福立 上海原子能所 兰化 2 液相色谱仪的组成 输液系统 进样系统 分离系统 控温系统 检测系统 样品收集系统 数据处理系统 色 谱 泵 进 样 器 数 据 处 理 检 测 器 色 谱 柱 2.1 输液系统 流路—单泵、双泵、三元泵、四元泵、多泵 压力—低压、中压、高压、超高压 控制方式—恒流、恒压 流动相—等度、梯度 混合方式—低压、高压 流量—分析泵、半制备泵、制备泵 材质—金属泵、非金属泵(peek) 液相色谱的溶剂输送系统 色 谱 泵 恒 压 泵 恒 流 泵 气 动 放 大 泵 注 射 泵 单 柱 塞 泵 双 柱 塞 泵 隔 膜 泵 并 联 泵 串 联 泵 不同梯度对系统体积的影响 低 压 梯 B AC D 度 比例阀 溶剂输送 系统(泵) 阻尼器 混合器 进样器 色谱柱 检测器 滞后(系统)体积 注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路 滞后(系统)体积 高 压 溶剂输送 系统(泵) 梯 度 溶剂输送 系统(泵) 进样器 梯度混合器 死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时) 色谱柱 检测器 泵运行的一般方式 1 液相色谱一般为金属泵,精度高,耐磨,peek泵一般 用于离子色谱(兼容反相,不能用于正相)。 2 分析型泵流量在0.01-10.0ml/min,标准为1.0ml/min, 不建议在较高的压力下用大流量。 3 如果采用比例阀切换流动相、流动相为低压混合,一 般需在线脱气才能运行(有多种方式)。最常见的为 四元比例阀。 单泵、双泵采用高压混合,不易产生气泡。精度比 比例阀高,因此目前也有四元高压混合的泵,如SSI、 Dionex,可以以二元、四元的方式组合。 多元泵(流路)用于组合研究的高档色谱仪。 4 HPLC一般运行的压力在几十到几百大气压;压力越 低对泵和色谱柱有利。低压色谱一般用于生化分析。 Waters最新的UPLC,可以在上千kg/cm2下运行。 5 对于简单的样品,多采用等度分析。但对于复杂样品 一般采用梯度方式,必须采用二元以上的泵体系。 6 一般运行为恒流方式,很少为恒压。 7 低压混合一般需在线脱气,否则极易出气泡。高压混 合不易出气泡。 常见HPLC泵指标 1.流量范围:0.001-9.999mL/min,设定步长0.001 mL/min; 2.准确度:±2%; 3.流量精度:RSD0.3% RSD0.5%; 4. 压力范围:40MPa(0.001-4.999mL/min), 20Mpa(5.000-9.999mL/min); 5.压力线.压力脉动:压力脉动不大于0.2MPa(流量为1ml/min, 压力8.5MPa条件下); 7.泵密封性:压力为40MPa,时间10min,压降不大于 0.5MPa; 2.2 进样系统 1 手动—高压六通进样阀—目前,全世界新的高效液相 色谱仪大都选配了Rheodyne公司的高压六通进样阀。 除了Rheodyne公司外,Valco公司也生产与销售高压六 通进样阀。早期非常有名的进样阀是Waters的U6K可变 体积进样器。 7725i是目前手动中最常见的一种,有不同规格的进样 环,最大可至5ml。 进样注射器为平头,不同于气相色谱。 2 自动(电动、气动)—其阀同手动基本一致。特点是 可自动连续进样、可自动调节进样量、进样重复性好、 适合大批量样品的分析,而且还可以稀释、添加标准、 重复进样、衍生等。 手动进样阀 取样时,流动相直接进柱,进样口与定量管连接,样 品充满定量管后,多余样品从6流出。 进样时,泵将流动相压入定量管,将样品全部进入色 谱柱分析。 自动进样器 可以用全自动或半自动的方式进多个样品 一般的设计用Rheodyne阀,气阀驱动 High-Pressure-Loop Injection Principle The sample is placed under the needle High-Pressure-Loop Injection Principle The needle descends through the septum High-Pressure-Loop Injection Principle The syringe draws in the required volume High-Pressure-Loop Injection Principle The needle retracts High-Pressure-Loop Injection Principle …and descends to become part of the flow path. 2.3 分离系统 色谱柱是HPLC的分离的关键,色谱柱有很多类型。 1 柱管—玻璃、PEEK、不锈钢 玻璃柱—低压分离,填料自己填装,常用于生化;或 早期的柱子;离子色谱也有这种规格。 PEEK—主要用于离子色谱柱。 不锈钢—大多采用这种类型,耐压,不宜变形。 2 类型—保护柱、分离柱、卡套柱等。 保护柱—加在分离柱前、与分离柱类型相同。 卡套柱—MERCK出的一种柱子,成本比较低。 3 规格大小—LC-MS柱、常规分析柱、制备柱等 LC-MS柱—细口径(2.1、3.2mm)、填料颗粒细(3.5um 或更细)、长度短(5-10cm)、流量小(0.1-0.5ml/min) 常规分析柱—口径在3.9-7.8mm(3.9、4.0、4.6、5、 7.8等)、填料颗粒在5-15um、长度10-30cm、流量在 1.0-5.0ml/min,使用最普遍。 制备柱—孔径大10mm到几百厘米,填料颗粒在550um或更粗,长度几十厘米到几米或更高、流量从十 几ml/min到几百升/min甚至更高。 4 填料—金属氧化物(Al2O3等)、硅胶(SiO2)、聚合物 (聚合的苯乙烯二乙烯苯等)、杂交柱(Xettra)、整 体化柱(chromolith)。 5 分离类型—正相、反相、离子交换、离子排斥、亲和、 排阻等。 色谱柱的保护 保护柱防止流动相 及样品中杂质对 色谱柱的损害。 可换芯式保护柱 新型的保护柱 — Sentry Guard 色谱柱的保护 ODS柱的使用注意点: 1)柱压低于150kgf/cm2 2)柱温在40℃左右,最高使用温度为50℃ 3)缓冲液PH使用范围为2~7 *硅胶在PH为3~4时稳定性最好 *碱浓度越低,流动相含水量越低,硅胶越稳定。 色谱柱标签的识别 R 1 Hibar 2 LichroCART R 250-4 R Purospher STAR RP-18e (5 um) R 3 Hithunter 柱子类型 1 传统柱(不需卡套) 柱内径(mm) 2 卡套柱(需卡套) 3 半制备柱 柱长(mm) 填料名称 粒径 端基封尾 十八烷基硅烷键合 填料类型 其Hibar?、LichroCART?、Hithunter?表示柱子的类型, 但大多数色谱柱厂家一般没有单独这样标识,用其它 表示来代替。 250-4表示柱子的长度为250mm、内径为4mm,是色谱 柱的主要参数,每根色谱柱上都有。 Purspher?STAR表示填料的品牌,一般专业色谱柱厂 家有很多不同名称的品牌。 RP-18e表示填料的类型为反相的C18,末端封尾,不同 类型的填料有不同的表示方法,是色谱柱的重要参数; 有的厂家为区别封尾和不封尾的柱子加上e或其它标识 来区别,但新型的色谱柱多为封尾,不加其它标识。 (5μm)表示填料颗粒的大小,填料还有一个重要参 数是孔径,分析柱在60-120?之间,而蛋白质分析的硅 胶柱多为300?。在一些色谱柱的标识中,这二个参数 常常与柱子填料的类型混在一起表示,如5C18表示颗 粒为5μm的C18柱。Si60 表示孔径为60?的硅胶柱。 有些色谱柱上还有一些数字,如批号、货号、柱子编 号等可以查询到色谱柱的出厂日期等,但用处并不是 很大。在色谱柱上有时还有厂家地址,名称等。 每根色谱柱都有流动相流向的标志,如果没有明显的 方向标志,则流动相的流向从左向右,沿着文字的阅 读方向。 色谱柱上最主要几个标识是填料名称、填料类型、柱 子规格。 常见色谱柱的类型 专业的液相色谱仪厂家都有色谱柱生产,除此外还有 很多专业的色谱柱厂家。 C18—又称ODS柱,使用最普遍、规格多,适合大多数 化合物的分析,市场上品种繁多,值得注意的是同样 的C18柱,得到的结果可能非常不一致,尤其是极性或 离子化合物。流动相为甲醇(乙腈)水系统。 C8—类同于C18柱,保留能力比C18差。 C4,C2,C1—反相,用于一些特定的化合物分析,寿 命较短。 NH2—既能用于反相又可用于正相,常用于小分子的 糖分析。 C6H5—苯基柱,适合芳香族化合物的分离。 CN—既能用于反相又可用于正相,用于某些杂环化合 物的分离。 OH—二醇基柱,一般用于正相分离,保留能力比Si强。 Si—硅胶柱,典型的正相柱,适合非极性化合物的分 离,流动相多为非极性的溶剂。 SAX—强碱性阴离子交换柱,硅胶基质,pH在3-7.5, 用于阴离子化合物的分离,如苯(萘)磺酸类、羧酸类。 SCX—强酸性阴离子交换柱,硅胶基质,用于阳离子 化合物的分离,如嘌呤、嘧啶类。 WAX—弱碱性阴离子交换柱,硅胶基质,用于特定的 化合物或生化分析。 WCX—强酸性阴离子交换柱,硅胶基质,用于特定的 化合物或生化分析。 氨基酸柱—专门用于氨基酸分析的C18柱。 其它特定的反相柱如C16、紫杉醇柱等。 离子交换柱—聚合物基质,一般为苯乙烯二乙烯苯聚 合的柱子,pH范围在0-14,适合在强酸强碱条件下分 析,但柱效低于C18柱。而且价格高。 离子色谱柱大多数为离子交换柱;聚合物柱子对蛋白 不易变性,常用于生化分析蛋白质等。 离子排斥柱—聚合物基质,一般为苯乙烯二乙烯苯聚 合的柱子,pH范围在0-14,如有机酸柱。 手性柱—用于特定的手性化合物的分类,多为正相, 适用范围窄,专一性强。 大多数反相的色谱柱填料在60-120 ? ,分析的分子量 小于2000,300 ?以上分析蛋白等大分子。 常见的色谱柱品牌 目前国内用的较多品牌的有 Zorbax、 Symmetry、LiChrosorb、mBondpak、Nova- Pak、Partisil、Ultrasphere、Resolve、Xettra、kromasil、 Diamonsil 、Lichrospher、shim-pack、chromotith、luna、 Purspher?STAR、cosmosil 2.4 控温系统 控温系统大多数并不是HPLC的必须备件,凝胶系统一 般是要求控温的,采用示差检测最好配置控温箱,离 子色谱也同样。 有些仪器除了加热的控温系统外,还自带低温冰箱。 液相色谱常规分析的柱温在20-60度。 不同温度对样品的保留时间有很大的影响。 柱温箱: 柱温控制的优点: 分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性 2.5 检测系统 检测器类型多,有很多分类方法: 通用型检测器 示差折光型检测器,电容检测器,蒸发光检测器等 选择型检测器 紫外-可见波长检测器,荧光检测器,电化学检测器等 HPLC检测器基本要求和特点 灵敏度高(10-6g)、线性范围宽、通用 响应快、响应值不受温度及流动相影响 噪音低、漂移小 死体积小,以保持高的分离效能 对样品无破坏性 定性定量信息 稳定、可靠、重现性好 方便,便宜 目前没有一种检测器能满足上述要求 检测器评价的几个参数 1 噪声—没有溶质通过检测器时,检测器输出的信号变化, 分为短噪声和长噪声。 2 漂移—基线随时间的增加朝单一方向的偏离。 3 灵敏度—一定量的物质通过检测器时所给的信号大小。 4 检测限—响应值为2(3)倍噪音时所需的样品量-信噪比。 5 线形范围—检测信号与被测物质量呈线 最小检测量和最低检测浓度—产生的信号等于2(3)倍噪 音时的进样量。 检测器的种类 商品HPLC检测器基本状况 1. 电化学2. 荧光3. DAD 4. RI 5. UV-VIS 6. 放射性7. LC-MS 8. LC-FTIR 1 紫外可见检测器(UV-VIS) 紫外检测器有很多类型,早期的单紫外(254nm), 以及插片式的固定多波长。 目前一般大多采用多波长的紫外可见检测器,检测波 长在190nm—900nm。紫外区采用氘灯、可见区采用钨 灯。 目前最多见到可以同时设定4个波长检测,并有停泵扫 描功能。 2 光电二极管阵列检测器 1975年首次报道了光电二极管阵列检测器。 1982年,HP公司推出了第一个SH商品化的HP1040A 。 简称PDA、PDAD、DAD等 可同时得到多个波长的色谱图 可计算得到最大吸收波长 可以得到时间-波长-吸收值为坐标的三维图形 可以对峰进行纯度检验和紫外定性。 3 荧光检测器 灵敏度极高 选择性好 线性范围宽 外界条件及流动相影响小 应用范围窄 背景荧光和淬灭荧光等干扰 激发波长 发射波长 4 示差检测器 目前最常用的通用型检测器。 总体性能检测器 浓度敏感性检测器 中等灵敏度 对压力和温度的变化很敏感 流动相流速影响检测信号(流通池的几何形状、大小 及材料、检测器的光路系统) 5 电化学检测器 测量溶液整体性质(通用性强) 电导检测器和电容检测器 测量溶质组分性质(灵敏度和选择性好) 安培、极谱、库仑、电位检测器 5.1 安培检测器 优点 灵敏度高、选择性好、线性范围宽 结构简单、检测池体积小 局限性 流动相必须有导电性 信号随流动相流速、温度、pH值等变化敏感 流动相中氧干扰 电极寿命 可分为直流安培、脉冲安培、积分安培 5.2 电导检测器 离子色谱法最主要检测器 测定多种阴阳离子的灵敏检测器 检测信号是离子电导与流动相电导之差、负值. 抑制柱降低本底电导. 温度对信号的影响比较大 可分为抑制电导和非抑制电导二种类型 5.3 库仑检测器 库仑阵列检测器 5.4 电势检测器 5.5 极谱检测器 5.6 介电常数检测器 常见电化学检测器的性质 6 蒸发光散射检测器 是90年代开始在全国普及,作为新一代通用检测器的 逐步替代示差检测器。 优点: 通用型质量检测器 灵敏度高于RI 可以进行梯度洗脱 可作为SEC和SFC色谱/细内径LC检测器 可测定磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂 限制: 受样品组分和流动相的挥发性的影响,不能完全替代 示差检测器 岛津的 ELSD-LT 7 质谱检测器 70年代末出现最早的质谱检测器,80年代后期电喷雾 技术的发展LC-MS技术开始成熟。 1992年, ESI(大气压电喷雾) 1993年, APCI技术的出现(大气压化学电离)为小及 中等分子量有机物,药物及代谢物分析提供了帮助。 目前质谱检测器应用越来越多。 LC-MS:结合HPLC对复杂基体化合物的高分离能力与 MS的独特选择性、灵敏度、分子量及结构信息与一体 困难在于LC-MS压力匹配问题、流量匹配问题、难挥 发溶剂的排除问题 LCMS - Shimadzus QP8000a LC-MS能够提供的质谱信息 化合物分子量(误差0.001%) 未知化合物碎片结构 信息 可用于无共价键、无官能团化合物的检测 完整谱图和多重扫描方式分析谱图: 色谱图、总离子流色谱图、质谱图、质量碎片图谱、 质量色谱图 2.6 样品收集系统 作为分析型的HPLC一般没有制备系统,如果制备MG 级的样品还是可以的。 但如果制备几十MG,一般分析柱是难以承受了,必须 要大口径的色谱柱,大的进样体积及大的流量。 制备克级的样品需用专门的制备色谱仪。专门的样品 自动收集系统以及溶剂回收系统。 不同制备规模的色谱柱 中试规模制备 色谱柱直径50-150mm 小量制备, 色谱柱直径10-40mm 生产规模制备 色谱柱直径100-800mm 瓦里安制备液相色谱系列 制备液相 色谱 快速色谱 分析液相色谱 工业规模制备色谱 中式规模制备色谱 半制备液相色谱 2.7 数据处理系统 早期采用记录仪,面积采用重量法来测定,准 确度差,结果不能长期保存。 数据处理机将数据处理功能固化到硬件上,准 确度大大提高,但修改参数麻烦,不能长时间 保存图谱。 早期的计算机采用各自的专用操作系统和软件, 系统价格贵、不通用。 近十年来,随着计算机运行速度的大大提高以 及PC的大量应用,目前数据采集和处理完全可 用普通微机代替,无需早期的专用计算机。 不同色谱仪的数据结果也有行业标准,如AIA、 CSV等格式或采用TXT格式对二维数据处理。 有的色谱工作站可以兼容其它公司的仪器,并 进行控制。 目前也有通用的色谱工作站,采用标准的接口 方式,(带TTL等)。 长图 记录仪 色谱数据 处理机 色谱数据 工作站

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